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May 17, 2024

Trascrizione inversa

Scientific Reports volume 13, numero articolo: 11470 (2023) Cita questo articolo 9845 Accessi 4 dettagli Altmetric Metrics La procedura illustrata in questo articolo rappresenta un nuovo metodo per il trascrittoma

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 11470 (2023) Citare questo articolo

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La procedura illustrata in questo articolo rappresenta un nuovo metodo per l'analisi del trascrittoma mediante PCR (reazione a catena della polimerasi), che evita la necessità di eliminare la potenziale contaminazione del DNA. Rispetto alle metodologie esistenti, il nostro metodo è più preciso, più semplice e più riproducibile perché preserva l'integrità dell'RNA, non richiede materiali e/o reagenti utilizzati per l'eliminazione del DNA e riduce inoltre il numero di campioni da allestire come controlli negativi. Questa nuova procedura prevede l'uso di un primer specificamente modificato durante la fase di trascrizione inversa, che contiene basi non corrispondenti, producendo così molecole di cDNA che differiscono dal DNA genomico. Utilizzando lo stesso primer modificato nell'amplificazione PCR, viene amplificato solo il modello di cDNA poiché il modello di DNA genomico è parzialmente eterologo al primer. In questo modo, l'amplificazione mediante PCR non è influenzata da alcuna potenziale contaminazione del DNA poiché è specifica solo per lo stampo di cDNA. Inoltre, riflette accuratamente la concentrazione iniziale di RNA del campione, che è soggetta a cambiamenti dovuti a vari trattamenti fisici o enzimatici comunemente utilizzati dalle attuali metodologie per l'eliminazione del DNA. Il metodo è particolarmente adatto per la quantificazione di trascrizioni di DNA altamente ripetitive, come il DNA satellite.

L'analisi qualitativa e/o quantitativa delle trascrizioni mediante amplificazione PCR è un metodo di scelta sia nella ricerca di biologia molecolare che nella diagnostica medica1. È ampiamente utilizzato per rilevare e quantificare molti tipi diversi di trascrizioni come RNA messaggero, RNA ribosomiale, RNA non codificante ecc. Le applicazioni più comuni includono l'analisi dell'espressione genica e l'identificazione precisa di un particolare microrganismo.

Per essere adeguatamente analizzato, l'RNA purificato viene sottoposto ad una fase preliminare e fondamentale di trascrizione inversa, attraverso la quale le molecole di RNA vengono convertite in cDNA (DNA complementare) dall'enzima trascrittasi inversa. L'RNA stesso, infatti, non può essere amplificato direttamente durante le successive fasi della PCR e deve necessariamente essere convertito in cDNA1. Il problema principale della maggior parte dei protocolli attualmente utilizzati risiede nella spesso presente contaminazione del DNA, che è impossibile differenziare chimicamente a livello strutturale dal cDNA da parte dell'enzima polimerasi durante l'amplificazione della PCR, causando così risultati falsi positivi2,3,4,5, 6,7. Per superare questa limitazione, tutti i protocolli attuali includono un paio di passaggi di eliminazione del DNA, sia durante la purificazione dell'RNA che durante la successiva fase di trascrizione inversa. In entrambi i casi il DNA verrebbe eliminato, o con l'ausilio di specifici filtri meccanici (colonne a base di silice) o tramite digestione enzimatica da parte di un enzima specifico, come la DNasi I (Deossiribonucleasi I)8. Tuttavia, questi trattamenti non sono efficaci al 100% per la rimozione del DNA, che spesso rimane sotto forma di contaminazione del DNA2,3. Ciò è particolarmente vero nel caso del DNA altamente ripetitivo che costituisce una parte sostanziale del genoma eucariotico ed è spesso trascritto a bassi livelli. Inoltre, è da sottolineare che qualsiasi procedura attuata per ridurre la concentrazione di DNA nel campione provoca sicuramente anche la riduzione della concentrazione iniziale dell'RNA stesso, molecola per sua natura instabile e facilmente degradabile.

Qui riportiamo un nuovo metodo per l'analisi del trascrittoma mediante PCR, in cui cDNA e DNA sono differenziati e quindi è esclusa la contaminazione da parte di quest'ultimo, producendo quindi risultati più precisi, affidabili e riproducibili.

I primer forward, reverse e modificati utilizzati per testare il nuovo protocollo sono illustrati nella Tabella 1. Il primer specifico modificato differisce rispetto ai primer forward e reverse non modificati in sole quattro alterazioni delle basi (mutazioni puntiformi) distribuite alternativamente con nucleotidi invariati e a partire dal Estremità 3' del primer (contrassegnato in grassetto nella Tabella 1).