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Mar 23, 2024

CRISPR/Cas12a combinato con RPA per il rilevamento di T. gondii nel sangue intero di topo

Parassiti e vettori volume 16, numero articolo: 256 (2023) Cita questo articolo 280 Accessi 1 Dettagli metriche altmetriche Il Toxoplasma gondii è un protozoo opportunista ubiquitario negli esseri umani e

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Il Toxoplasma gondii è un protozoo opportunista onnipresente nell'uomo e negli animali. Può invadere qualsiasi organo umano e causare malattie gravi, tra cui oftalmopatia da toxoplasma, meningoencefalite e necrosi epatica. La toxoplasmosi suina è prevalente in Cina. I sistemi CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) e Cas (CRISPR-Associated Protein) sono ampiamente utilizzati per l'editing genetico e il rilevamento di agenti patogeni. La diagnostica basata su CRISPR è un test molecolare sviluppato per rilevare i parassiti con elevata sensibilità e specificità.

Questo studio mirava a stabilire un metodo di rilevamento rapido combinato CRISPR/Cas12a e RPA per T. gondii prendendo di mira il gene B1 e l'elemento ripetuto di 529 bp (529 RE). I risultati del rilevamento potrebbero essere visualizzati mediante la fluorescenza o le strisce a flusso laterale (LFS). Sono state valutate la sensibilità e la specificità del metodo e per il rilevamento è stato utilizzato sangue di topo infetto da T. gondii.

I risultati hanno indicato che il metodo stabilito per il rilevamento di T. gondii era soddisfacente, con un limite di rilevamento di 1,5 cp/μl per i due loci. Inoltre, il gene B1 potrebbe rilevare 1 tachizoite per reazione e il 529 RE potrebbe rilevare 0,1 tachizoite per reazione, in linea con i risultati altamente sensibili della reazione a catena della polimerasi annidata (PCR). Il metodo era adatto ai ceppi, incluso RH, e non presentava reattività crociata con il DNA di altri protozoi con abitudini simili. I campioni di sangue di topo infetto da T. gondii erano tutti positivi per T. gondii a 1, 3 e 5 giorni dopo l'infezione (dpi).

Questo studio ha stabilito un metodo di rilevamento del DNA rapido, sensibile e rapido per T. gondii che ha il potenziale per essere uno strumento alternativo per il rilevamento di T. gondii sul campo.

La toxoplasmosi è una malattia dell’uomo causata da un parassita intracellulare specializzato, il Toxoplasma gondii, con distribuzione mondiale [1]. Il Toxoplasma gondii gondii può infettare tutti gli animali a sangue caldo, compreso l’uomo [2]. Negli individui immunocompetenti, l'infezione da T. gondii può causare sintomi simil-influenzali che persistono per settimane o mesi prima di risolversi. Tuttavia, gli individui immunocompromessi, come quelli con sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS), gli anziani e quelli che assumono farmaci immunosoppressori, corrono un rischio maggiore di malattie gravi e persino di morte a seguito di infezione da T. gondii [3]. Le donne incinte infette da T. gondii sono anche a rischio di toxoplasmosi congenita nel feto, che può portare a una serie di esiti avversi come aborto, malformazione o feto morto [4]. È stato segnalato che il tasso sierologico positivo di T. gondii negli esseri umani in alcune regioni della Cina raggiunge il 23,41%, indicando che l’infezione è diffusa nel paese [5]. Oltre al suo impatto sulla salute umana, T. gondii ha un impatto significativo sulla zootecnia, con studi che dimostrano che la sieroprevalenza globale di T. gondii nei suini è del 19% [6]. L'infezione da T. gondii nei suini può presentare una serie di sintomi, tra cui febbre, diarrea, edema polmonare e aborto nelle scrofe. Dato che la carne suina è una fonte primaria di carne per l’uomo, la toxoplasmosi suina aumenta la possibilità di infezione umana da T. gondii. La prevenzione e lo screening di T. gondii stanno diventando sempre più importanti. Tuttavia, la mancanza di sintomi clinici specifici della toxoplasmosi rappresenta una sfida per la diagnosi, evidenziando la necessità di sviluppare metodi di rilevamento di T. gondii più efficaci.

Il rilevamento del Toxoplasma gondii gondii può essere ottenuto attraverso una varietà di metodi, comprese tecniche eziologiche, immunologiche e molecolari. I metodi eziologici, come gli strisci di liquido peritoneale e la colorazione delle sezioni istologiche, richiedono molto tempo e hanno un alto tasso di falsi negativi. I test immunologici, come il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), sono i metodi più comuni per rilevare la toxoplasmosi. Sebbene l’ELISA sia semplice e rapida, i pazienti nel periodo finestra dell’infezione potrebbero non essere rilevati e vi sono vari fattori interferenti, come il fattore reumatoide [7]. Inoltre, i pazienti con leucemia linfocitica cronica (LLC) e ipogammaglobulinemia secondaria possono produrre risultati falsi negativi a causa della loro incapacità di produrre anticorpi IgG [8]. Nella biologia molecolare, la tecnologia PCR è la più utilizzata. Burg et al. nel ventesimo secolo ha utilizzato con successo la tecnologia PCR per rilevare il DNA di T. gondii dal sangue utilizzando il gene B1 come gene bersaglio [9]. L'uso di geni conservati, come il gene P30 e il gene SAG1, ha avuto successo nel rilevare T. gondii [10, 11]. La PCR quantitativa (Q-PCR) è un utile derivato della PCR che può essere utilizzato sia per analisi qualitative che quantitative. Tuttavia, la Q-PCR richiede strumenti costosi e precisi, limitandone l’uso al laboratorio e rendendola inadatta alle applicazioni sul campo.